前期準備主要是提取、反轉錄和引物設計部分。

1. RNA 提取注意事項

首先了解一下，RNA 抽提原則：保證 RNA 的一級結構、無其它物質的污染、得率高、覆蓋有轉錄本。再比較一下 Trizol 提取和試劑盒提取，Trizol 提取相對來說耗時長、含有害化學物質、純度低、RNA 完整度不高；而試劑盒提取的優點是效率高、純度高、完整度高，各位可根據實際科研情況選擇操作方法。

RNA 提取注意事項：

① 使用無 RNase 的塑料制品和槍頭，玻璃器皿要消毒，避免交叉污染；使用性能較好的移液器，如 Eppendorf、Thermo 等；

② DEPC 有劇毒，小心配制；配制溶液應使用無 RNase 的水；

③ 操作人員應戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套；

④ 樣品應避免反復凍融，否則影響提取 RNA 提取得率和質量；

⑤ 若下游實驗對 DNA 非常敏感，可用不含 RNase 的 DNase I 對 RNA 進行處理。

2. 反轉錄注意事項

秉承避免 RNA 被污染和降解的原則，按照產品說明書進行即可，本文對反轉錄過程的引物設計和注意事項給出了較明確的提示。

3. qPCR 引物設計注意事項

qPCR 過程中需要使用基因特異性引物擴增，從而分析目的基因表達量。

① 使用軟件 Primer Premier 5.0；

② qPCR 過程中使用引物長度 25bp ，擴增產物長度 150bp ，可在 100bp-300bp 之間；

③ 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不宜過2℃，Tm 值在 60℃-65℃ 之間為佳；

④ 引物堿基分布要均勻，避免出現連續的4個相同堿基，GC 含量控制在50%左右，3’端*一個堿基*為 G 或 C；

⑤ 引物內部或者正反兩條引物間*避免出現有3個堿基以上的互補序列；

⑥ 引物特異性需要用 NCBI BLAST 程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補；

⑦ 引物設計完成后需進行擴增效率檢測，將擴增效率相同的引物用于定量比較分析。