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    PCR技術操作過程前期準備

    來源: 上海博湖生物科技有限公司 >> 進入該公司展臺 2021/10/07 10:55:31 已瀏覽:
    導讀:PCR技術操作過程前期準備

    前期準備主要是提取、反轉錄和引物設計部分。

    1. RNA 提取注意事項

    首先了解一下,RNA 抽提原則:保證 RNA 的一級結構、無其它物質的污染、得率高、覆蓋有轉錄本。再比較一下 Trizol 提取和試劑盒提取,Trizol 提取相對來說耗時長、含有害化學物質、純度低、RNA 完整度不高;而試劑盒提取的優點是效率高、純度高、完整度高,各位可根據實際科研情況選擇操作方法。

    RNA 提取注意事項:

    ① 使用無 RNase 的塑料制品和槍頭,玻璃器皿要消毒,避免交叉污染;使用性能較好的移液器,如 Eppendorf、Thermo 等;

    ② DEPC 有劇毒,小心配制;配制溶液應使用無 RNase 的水;

    ③ 操作人員應戴一次性口罩和手套,實驗過程中要勤換手套;

    ④ 樣品應避免反復凍融,否則影響提取 RNA 提取得率和質量;

    ⑤ 若下游實驗對 DNA 非常敏感,可用不含 RNase 的 DNase I 對 RNA 進行處理。

    2. 反轉錄注意事項

    秉承避免 RNA 被污染和降解的原則,按照產品說明書進行即可,本文對反轉錄過程的引物設計和注意事項給出了較明確的提示。

    3. qPCR 引物設計注意事項

    qPCR 過程中需要使用基因特異性引物擴增,從而分析目的基因表達量。

    ① 使用軟件 Primer Premier 5.0;

    ② qPCR 過程中使用引物長度 25bp ,擴增產物長度 150bp ,可在 100bp-300bp 之間;

    ③ 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不宜過2℃,Tm 值在 60℃-65℃ 之間為佳;

    ④ 引物堿基分布要均勻,避免出現連續的4個相同堿基,GC 含量控制在50%左右,3’端*一個堿基*為 G 或 C;

    ⑤ 引物內部或者正反兩條引物間*避免出現有3個堿基以上的互補序列;

    ⑥ 引物特異性需要用 NCBI BLAST 程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補;

    ⑦ 引物設計完成后需進行擴增效率檢測,將擴增效率相同的引物用于定量比較分析。

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